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本制品可测动物血清、血浆、尿液、细胞培养液、组织及各种水产等样本中羟脯氨酸的含量。

羟脯氨酸在氧化剂的作用下所产生的氧化产物与二甲氨基苯甲醛作用呈现紫红色，根据其呈色的深浅可推算出其含量。

羟脯氨酸在胶原蛋白中占13.4%，在弹性蛋白中占极少量，其它蛋白中均不存在。而胶原蛋白大多分布在皮肤、腱、软骨、血管等处，因此羟脯氨酸的量能反映结缔组织疾病的胶原代谢情况。

有人把皮肤中羟脯氨酸的测定作为筛选抗衰老药物的一个指标。在发育阶段随年龄的增长，其羟脯氨酸在尿中排泄增加，而发育停止后稳定。老年人的羟脯氨酸比年轻人要少。

鼠患有自发性高血压及继发性高血压时，尿中羟脯氨酸含量增加。

手术创伤会导致尿羟脯氨酸排泄量的增加，因高脂、低蛋白、酒精中毒及毒物、营养不良，或肝细胞变性坏死，通过炎症使纤维增加，分割肝小叶，导致肝硬化。肝纤维化时，肝内主要增加的成分为胶原纤维，羟脯氨酸为胶原纤维所特有，测定肝羟脯氨酸的含量，可换算成肝胶原蛋白的含量，以反映肝纤维化程度。胶原纤维分解主要依赖胶原酶和其它蛋白酶的作用，其分解产物羟脯氨酸从尿中排出，测定尿羟脯氨酸的含量，可反应胶原降解的情况。

通过测定组织及尿中羟脯氨酸的含量，一方面可以判断纤维化程度，同时可以筛选预防与治疗的药物。

• 试剂一应用液：临用时将粉剂一瓶，先加甲液10mL充分溶解（从瓶口向内看，完全溶解完）。然后再加乙液20mL充分混匀。配好后的试剂4℃～8℃冰箱保存3个月有效。
  
  • 粉剂加甲液10mL后一定要完全溶解后才能加乙液。
• 试剂三应用液：临用时将粉剂一支加到30mL溶剂中充分溶解，配好后4℃冰箱避光保存1个月有效。
  
• 100μg/mL标准储备液的配制：测试前将一支标准品用双蒸水溶解后定容至50mL，4℃冰箱保存2周。
  
• 5μg/mL标准储备液的配制：取100μg/mL标准贮备液1mL加双蒸水定容至20mL，现用现配。

• 样本水解：
  
  • 血清(浆)：取0.5mL血清(浆)准确加碱水解液1mL，混匀。放试管中加盖后，95℃或者沸水浴水解20分钟。
    
  • 尿液(培养液)：取1.0mL尿液(培养液)准确加碱水解液1mL，混匀。放试管中加盖后，95℃或者沸水浴水解20分钟。
    
  • 组织：精确称取组织湿重30～100mg放入试管中，准确加碱水解液1mL，混匀。加盖后95℃或者沸水浴水解20分钟。
    • 水解10分钟时混匀一次，可使水解更充分。
• 调pH值至6.0～6.8左右。
  
  • 将各试管流水冷却后各管加pH指示剂10μL左右，摇匀；
    
  • 各管准确加入调pH甲液1.0mL，混匀（此时溶液应为红色）；
    
  • 用200μL的加样器吸取调pH乙液向各管内逐滴小心加入调pH乙液，每滴加入后均要混匀^①，直至液体中指示剂的颜色变成黄绿色^②(亦即红色消失时)。此时pH值在6.0～6.8左右（约加入调pH乙液100μL～500μL左右）；
    
    • ① 加调pH乙液时，每加一滴均要混匀，为防止液体外溢，如果没有带盖的玻璃磨口试管，可用普通玻璃试管代替，每次混匀时可用塑料薄膜或冰箱保鲜膜压住试管口，充分漩涡混匀即可。
      
    • ② 若您的样本是细胞培养液，因其中含有酚红，所以液体中的混合指示剂在pH为6.0～6.8左右时为橙黄红色，而不是黄绿色。
  • 然后加蒸馏水至10mL，混匀；
    
  • 取3～4mL稀释的水解液加适量活性炭（约20～30mg左右，以上清液离心后澄清无色为准），混匀，3500转/分离心10分钟，小心取上清1mL作检测。
    
    • 样本碱水解法的参考取样量：皮肤组织湿重0.03～0.05g，软骨湿重0.08～0.1g，肝组织湿重0.08～0.1g，细胞培养液0.5mL，血清（浆）0.5mL。
      
    • 加水解液及调pH值甲液一定都要准确，否则较难调pH值。
      
    • 样本称重时，一定要很准确，以免影响测定结果。先将组织在保鲜薄膜上剪成湿重约10mg左右的块状后再连同保鲜薄膜一起称重，称完后将样本放进试管中，再将保鲜薄膜称重，计算出组织净重量。
      
    • 如果您的样本量少，则可以从取样，水解，调pH均按比例减少，不影响结果。
      
    • 每次混匀时可用塑料薄膜或冰箱保鲜薄膜压住试管口，充分漩涡混匀，以免混匀过程中液体外溅。
      
    • 95℃或者沸水浴时可以用带盖的玻璃磨口试管，也可用普通玻璃试管代替，用抱保鲜薄膜封口扎紧，用针头刺一小孔即可。我们建议用普通玻璃试管比带盖的玻璃磨口试管更安全。

• 按下表加入各成分
  

  成分	空白管	标准管	测定管
  蒸馏水	1mL
  5μg/mL标准应用液		1mL
  检测液			1mL
  试剂一应用液	0.5mL	0.5mL	0.5mL

  
  
• 混匀，静置10分钟。
  
• 向各反应管中加入0.5mL试剂二。
  
• 混匀，静置5分钟。
  
• 向各反应管中加入0.5mL试剂三应用液。
  
• 混匀，60℃水浴15分钟，冷却后，3500转/分离心10分钟，取上清在550nm处，1cm光径，蒸馏水调零，测各管吸光度。

• 血清(浆)、尿液、培养液样本：
  
  • 计算公式：
    

    羟脯氨酸含量 (μg/mL)	＝	A测定－A空白	×	标准管浓度 (5μg/mL)	×	水解液总体积
    		A标准－A空白				取样量

    
    
  • 计算举例：
    
    • 准确吸取正常大鼠血清0.5mL（样本量少，则可以从取样，水解，调pH均按比例减少。）按操作步骤进行检测。测得空白管吸光度为0.016，标准管吸光度为0.587，测定管吸光度为0.408。则计算结果为：
      

      羟脯氨酸含量 (μg/mL)	＝	0.408－0.016	×5×	10	＝68.651μg/mL
      		0.587－0.016		0.5

      
      
    • 准确吸取正常人尿液1.0mL（样本量少，则可以从取样，水解，调pH均按比例减少。）按操作步骤进行检测。测得空白管吸光度为0.016，标准管吸光度为0.587，测定管吸光度为0.128。则计算结果为：
      

      羟脯氨酸含量 (μg/mL)	＝	0.128－0.016	×5×	10	＝9.807μg/mL
      		0.587－0.016		0.1

• 组织样本：
  
  • 计算公式：
    

    羟脯氨酸含量 (μg/mg湿重)	＝	A测定－A空白	×	标准管浓度 (5μg/mL)	×	水解液总体积(mL)
    		A标准－A空白				组织湿重(mg)

    
    
  • 计算举例：
    准确吸取正常大鼠肝组织湿重61.4mg（样本量少，则可以从取样，水解，调pH均按比例减少。）按操作步骤进行检测。测得空白管吸光度为0.015，标准管吸光度为0.538，测定管吸光度为0.161。则计算结果为：
    

    羟脯氨酸含量 (μg/mg肝组织湿重)	＝	0.161－0.015	×5×	10	＝0.227μg/mg＝227μg/g
    		0.538－0.015		61.4